MJさむらいの実験室

454のホームページや論文を読んだら書いてあるのですが、
信じられない発想なので理解しがたいと思いますので日本語で説明します。
Margulies et al., 2005, Ｎａｔｕｒｅ, 437, 376-380
http://www.454.com/index.asp

そもそも４５４シークエンサーはゲノムを一度に多量にシークエンスするために開発されました。
一度にというのは、一回のランでという事です。
ぶつぶつに切ったゲノムＤＮＡをサンプルにしてランダムに読むのですが、
一度のランで３００,０００readsも得る事ができます。
しかし、各ＲＥＡＤＳは平均１２０ｂｐと短いです。

上の写真をクリックすると拡大できるので見てください。
ゲノムをブツブツにきります。シアーリングといって、物理的にきります。
この論文では、ＤＮＡを混ぜた液体で霧を作ることで、ＤＮＡを小さな断片にしました。

各ＤＮＡ断片の端にＡとＢのアダプターをつけます。Ｂのアダプターがついたほうがシークエンスが始まる側になります。

一番右側の図はどうやってアダプターをつけるかという説明の図ですが、ややこしいので説明はしませんが、
ビオチンをつかってうまくＡとＢのアダプター対になっているシングルストランドの断片だけを抽出する方法です。詳しくは論文のサプリメンタルデーターで。

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無理無理

Conversion of a trans-spliced C.elegans gene into a conventional gene by introduction of a splice donor site
Richard Conrad, Ruey Fen Liou and Thomas Blumenthal
The EMBO Journal vol.12 no.3 1249-1255, 1993

ＳＬトランススプライシングの５'上流にエクソンのドナーサイトを挿入すると、
ＳＬトランススプライシングがシススプライシングに変わるのかという事を調べている論文。

しかし、なんとも読みにくい。
図が書いてあるのだが、その図をフォローするのがかなり難しい。
こういう論文はなんとも眠くなってしまうのだが、自分が行おうとしている実験と似ているので
何とかすべての実験をフォローしておかなくては。

また、最近のトランススプライシングに関する自分のアイデアが本当に正しいかどうか、
という視点から
この論文の実験の結果を解釈してみたい。


アウトロン（outron)にシススプライシングのドナーサイトを挿入した。
その結果、ＳＬトランススプライシングの代わりにシススプラシングが誘導できたというのが主な実験結果。

SLトランススプライシングはシススプライシングと同じメカニズムで起きているだろうということを示唆している。

その際、すべてのｍRNAがシススプライシングされたわけではなくて、ＳＬトランススプライシングも同時に起きてしまった。しかし、より、トランススプライシングのアクセプターサイトの近くにドナーサイトを挿入したほうが効率よくシススプライシングが起きた。

なぜこのようなことがおきるのか、ぼくの考えている理屈に当てはめて考えると納得がいく解釈ができる。
が、この論文の中では良い解釈が見つかっていないようだ。

この後の実験で、イントロンの長さが関係しているのではないかと考えて、
イントロンの部分を長くしたらどうなるかと言うことを試している。
しかし、長くしても人工的なシスプライシングの効率は変わらないと言う結果にがでて、その後の解釈に苦労している。