MJさむらいの実験室

次に、エマルジョン（emulsion)ＰＣＲです。
アダプターをつけたＤＮＡ断片をＰＣＲをしながらビーズに固定してクローン化されたビーズを作ります。
この作業によってＤＮＡ断片のクローニング作業が必要なくなります。めちゃくちゃ楽です。

まず、大量のアダプターＡプライマーが固定化されたビーズとアダプターをつけた一本鎖のアダプターがついたＤＮＡをＰＣＲバッファー（プライマー入り）とオイルが混ざった溶液にいれて攪拌します。
すると、エマルジョンができて、中には一つのＤＮＡ断片と一つのビーズが入った状態のものがあります。

なんと、このままＰＣＲをかけるんです。
各エマルジョンの中でＰＣＲ反応がはじまります。

そうすると、固定化されたＤＮＡ断片が増殖したビーズが出来上がります。

うそみたいな話ですが。

このウニみたいな感じになったビーズについているＤＮＡ断片はすべて同じＤＮＡ断片が複製されたものです。

一番右はエマルジョンの写真です。

参考
Margulies et al., 2005, Ｎａｔｕｒｅ, 437, 376-380
http://www.454.com/index.asp

454のホームページや論文を読んだら書いてあるのですが、
信じられない発想なので理解しがたいと思いますので日本語で説明します。
Margulies et al., 2005, Ｎａｔｕｒｅ, 437, 376-380
http://www.454.com/index.asp

そもそも４５４シークエンサーはゲノムを一度に多量にシークエンスするために開発されました。
一度にというのは、一回のランでという事です。
ぶつぶつに切ったゲノムＤＮＡをサンプルにしてランダムに読むのですが、
一度のランで３００,０００readsも得る事ができます。
しかし、各ＲＥＡＤＳは平均１２０ｂｐと短いです。

上の写真をクリックすると拡大できるので見てください。
ゲノムをブツブツにきります。シアーリングといって、物理的にきります。
この論文では、ＤＮＡを混ぜた液体で霧を作ることで、ＤＮＡを小さな断片にしました。

各ＤＮＡ断片の端にＡとＢのアダプターをつけます。Ｂのアダプターがついたほうがシークエンスが始まる側になります。

一番右側の図はどうやってアダプターをつけるかという説明の図ですが、ややこしいので説明はしませんが、
ビオチンをつかってうまくＡとＢのアダプター対になっているシングルストランドの断片だけを抽出する方法です。詳しくは論文のサプリメンタルデーターで。

スプライシングリーダー（ＳＬ）トランススプライシング

ＳＬトランススプライシングが起こる生き物は進化的に不可解。
ＳＬトランススプライシングは一部の生き物で起こる特別なスプライシングである。
ユーグレナ、線虫、脊索動物、ヒラムシ、ヒドラ、ワムシで見つかっている。
英語では、euglenozoans, nematodes, chordates, flatworms, cnidarians, rotifersとなる。
植物、昆虫、脊椎動物では見つかっていない。











ＳＬトランススプライシングの仕組み。
通常のシススプライシングと比べればわかりやすいが、シススプライシングでは５'側のエクソンの３'端がドナーサイトとなる。ＳＬトランススプライシングではスプライシングリーダー配列（ＳＬＲＮＡ）がドナーサイトとなる。ＳＬトランススプライシングはシススプライシングと似たメカニズムで起こっていると考えられている。ＳＬトランススプライングが起こると、それより上流は切り取られてしまうので、ＳＬは常にｍＲＮＡの５'端につく。 ちなみに、ＳＬトランススプライシングで切り取られてなくなってしまう部分をアウトロン（outron)という。ＳＬトランススプライシングが働くためには、ブランチポイント(Branchpoint)Ａとpolypyrimidineサイトが必要だ。